具体步骤参见下面流程图中的蓝色部分:
简单地说，DESeq2将对原始reads进行建模，使用标准化因子(scale factor)来解释库深度的差异。然后，DESeq2估计基因的离散度，并缩小这些估计值以生成更准确的离散度估计，从而对reads count进行建模。最后，DESeq2拟合负二项分布的模型，并使用Wald检验或似然比检验进行假设检验。
为什么说DESeq2复杂呢？因为上一篇文章讲了七个步骤，也仅仅只是完成了这个流程图中Estimate size facors这一步。
在使用DESeq2进行基因表达差异分析之前，最重要的是明确我们的研究目的，了解数据中的变异来源。一旦我们了解了数据的主要变异来源，就可以在分析之前提前移除它们，或者通过将这些变量包含在统计模型的公式中对它们进行分析。
在RNA-seq中进行两组间的差异分析是最正常不过的了。
我们在其它实验中同样会遇到类似的分析，通常，我们可以用方差分析判定两组“分布”数据间是否存在显著差异。原理是：当组间方差大于组内方差（误差效应），并且统计学显著时，则认为组间处理是可以引起差异的。
有伙伴肯定要问，转录组数据到底有什么了不起的？它们为什么不能用我们熟悉的算法简单地进行计算？
其实统计学家也很无奈啊，看看我们转录组实验得到的这些数据吧：我们的实验只进行少得可怜的生物学重复（n<10），而且，任何基因的表达量都不能是负数，这些数据并不符合正态分布，用于表征表达量的counts是非连续的（芯片信号是连续的），RNA-seq数据的离散通常是高度扭曲的，方差往往会大于均值……，就这些奇怪的特征，使得准确估计方差并没有想象的那么容易。
loom 文件逐渐被广泛用于单细胞数据存储，Seurat Team 研发了 LoomR 包用于处理 loom 文件，并与 Seurat 包无缝接合。本文翻译了 Seurat 网站上对于 LoomR 包的介绍。原文发表于 2018-04-22。
单细胞数据量越来越大，计算需求也以指数形式增长。Seurat Team 发现，尽管使用 sparse matrices， 对于分析 > 100,000 数目的细胞，也是一个严峻挑战，主要的困难是在内存中加载存储单细胞数据。HDF5数据格式可以解决这个问题，它不是在内存中存储数据，而是在硬盘上进行有效的数据存储，因而也适用于百万级的细胞数目。
主要是 awk/grep/sed 这三驾马车，加上vi这个神器，最后辅助一些小工具，包括 wc,cat,diff,join,paste,cut,uniq。
这里 简要地整理下 Linux 用来处理数据文本的工具。具体命令详情请在 Linux 命令大全中搜索或者查阅其他相关资料。
head, tail 查看文档头尾。 -n 选项可以指定行数。
less 用来查阅文档， q 退出， space bar 翻页， g 第一行， G 最后一行， j 下， k 上, /<pattern> 往下搜索模式， ?<pattern> 往上搜索模式， n 前一个匹配字符， N 后一个匹配字符。
Linux 是一个多用户的操作系统。每个用户登录系统后，都会有一个专用的运行环境。 通常每个用户默认的环境都是相同的，这个默认环境实际上就是一组环境变量的定义。环境变量是全局的，设置好的环境变量可以被所有当前用户所运行的程序所使用。 用户可以对自己的运行环境进行定制，其方法就是修改相应的系统环境变量。
环境变量有很多，需要重点理解的就是 PATH 。
比如说：bwa软件就没有添加到环境变量，所以需要用全路径，指明使用电脑里面什么地方的bwa软件来做数据分析，而 samtools 我已经添加到环境变量了，所以可以直接调用。
可以把 Linux 的学习过程分成6个阶段，一般来说，每个阶段都需要至少一天以上的学习：
linux系统玩得跟 Windows 或者 MacOS 那样的桌面操作系统一样顺畅，主要目的就是去可视化，熟悉黑白命令行界面，可以仅仅以键盘交互模式完成常规文件夹及文件管理工作。awk,sed,grep``这文本处理的三驾马车。